Protocolo de electroforesis para pruebas de género de ADN en aves: Una guía paso a paso

Cómo realizar pruebas de género de ADN en aves mediante el protocolo de electroforesis?

La prueba de género de ADN de aves es uno de los métodos más confiables y no invasivos para los criadores., investigadores, y entusiastas de las aves. Electroforesis es un paso clave para confirmar los resultados de las pruebas de sexado de aves basadas en PCR. En esta guía, te explicamos detalladamente, Protocolo de electroforesis paso a paso para pruebas de género de ADN de aves..

Lo que necesita para las pruebas de género en aves

antes de empezar, asegúrese de tener el siguiente equipo y reactivos:

Equipo:

• Cámara de electroforesis en gel y fuente de alimentación.

• Micropipetas y puntas

• Bandeja de gel y peines.

• Transiluminador de luz ultravioleta o azul

reactivos:

• Polvo de agarosa (1–2% gel dependiendo del tamaño del fragmento)

• Tampón TAE o TBE

• tinción de ADN (Bromuro de etidio, Seguro SYBR, o GelRojo)

• escalera de ADN (tamaño estándar)

• Productos de PCR (Amplificación del gen CHD a partir de ADN de plumas o sangre)

Paso 1: Preparar gel de agarosa

1. Mida 1-2 g de agarosa en polvo para una 100 ven ml (1–2% dependiendo del tamaño esperado del fragmento de PCR).

2. Añadir agarosa a Tampón TAE o TBE en un recipiente apto para microondas.

3. Calentar hasta que esté completamente disuelto., asegurándose de que la solución sea clara y sin partículas.

4. Deje que la solución se enfríe a ~50 °C antes de agregar el tinte de ADN. (si se utiliza un método de tinción previa).

5. Vierta el gel en la bandeja de fundición con un peine colocado y déjelo solidificar. (alrededor de 20 a 30 minutos).

Paso 2: preparar muestras

1. Mezcle su producto de PCR (Amplificación del gen CHD) con un tinte de carga.

2. Asegúrese de que el tinte se mezcle uniformemente para realizar un seguimiento de la migración..

3. Prepare la escalera de ADN en un pozo separado para que actúe como referencia de tamaño..

Paso 3: Cargar el gel

1. Retire con cuidado el peine del gel solidificado..

2. Coloque el gel en la cámara de electroforesis y cúbralo con tampón..

3. Cargue las muestras de PCR y la escalera de ADN en pocillos separados utilizando una micropipeta..

4. Registre las posiciones de las muestras para identificar los resultados masculinos y femeninos más adelante.

Paso 4: Ejecutar electroforesis

1. Conecte la cámara a la fuente de alimentación..

2. Ajustar el voltaje según el tamaño del gel. (normalmente 5-10 V/cm de longitud del gel).

3. Corre hasta que el frente del tinte llegue 2/3 de la longitud del gel (generalmente de 30 a 60 minutos).

4. Apague la fuente de alimentación y retire con cuidado el gel..

Paso 5: Visualiza el ADN

1. Coloque el gel en un Transiluminador UV o de luz azul.

2. Observe las bandas de ADN correspondientes a fragmentos del gen CHD..

3. Interpretar los resultados:

   • Pájaros machos (Zz): Una banda correspondiente al fragmento CHD-Z.

   • Pájaros femeninos (ZW): Dos bandas correspondientes a fragmentos CHD-Z y CHD-W.

Nota: Los tamaños de las bandas varían ligeramente según las especies y los cebadores utilizados., pero este patrón es consistente para la mayoría de las aves..

Consejos para obtener resultados confiables de las pruebas de género en aves

• Utilice productos de PCR nuevos para la electroforesis.

• Evite las burbujas al verter geles.

• No sobrecargue los pocillos con demasiada muestra de ADN..

• Utilice una escalera de ADN con un rango de tamaño similar al de los fragmentos de PCR esperados..

• Utilice siempre guantes y gafas protectoras al manipular tinciones de ADN..

Conclusión

La electroforesis es un paso esencial en Sexado de aves basado en ADN, proporcionando una confirmación clara y visible de los resultados de la PCR. Seguir este protocolo permite a los criadores, investigadores, y laboratorios para determinar de manera confiable el género de las aves a partir de una pluma, sangre, o muestra de cáscara de huevo.

Realizado correctamente, este método es preciso, reproducible, y no invasivo, convirtiéndolo en una práctica estándar en genética aviar y programas de reproducción.

Referencias (QUE estilo)

• Griffiths, r., Doble, METRO. DO., Orr, K., & dawson, R. j. GRAMO. (1998). Una prueba de ADN para sexar la mayoría de las aves. Ecología molecular, 7(8), 1071–1075.

• Laboratorio de Genética Aviar Natural. (2020). Protocolos de pruebas de ADN de género de aves. Obtenido de https://www.naturalavianlab.com

El proceso de electroforesis en gel en el sexado del ADN de aves

¿Qué sucede después de la amplificación por PCR??

Después de que la máquina de PCR amplifica los fragmentos del gen CHD, La solución de ADN resultante se carga en un gel de agarosa.. Se aplica una corriente eléctrica, haciendo que los fragmentos de ADN cargados negativamente migren a través de la matriz del gel. Los fragmentos más pequeños viajan más rápido y más lejos que los más grandes: esta separación basada en el tamaño es el principio detrás de la determinación de género..

Leyendo el gel: ZZ contra. Patrones ZW

El fragmento CHD-Z (del cromosoma Z) y fragmento CHD-W (del cromosoma W) tienen pesos moleculares ligeramente diferentes debido a polimorfismos de longitud de intrones. Cuando se visualiza bajo luz ultravioleta:

• Masculino (Zz): Una sola banda de ADN: solo está presente el fragmento CHD-Z
• Femenino (ZW): Dos bandas de ADN distintas: fragmentos CHD-Z y CHD-W

Nuestro laboratorio utiliza 2% geles de agarosa con tinción con bromuro de etidio para una resolución óptima de la banda y ejecuta una escalera de ADN (marcador de tamaño) en cada gel para una verificación precisa del tamaño de los fragmentos.

Control de calidad en el sexado basado en electroforesis

Prevención de resultados falsos

Cada aplicación de gel en SENO Biotech incluye:

• Controles positivos: Muestras masculinas y femeninas conocidas para verificar patrones de bandas.
• Controles negativos: Controles sin plantilla para detectar contaminación
• escalera de ADN: 100 Marcador de peso molecular de pb para referencia del tamaño del fragmento.
• Ejecuciones duplicadas: Los resultados ambiguos se repiten automáticamente en un gel nuevo

Cuando la electroforesis no es suficiente

En aproximadamente 2-3% de casos, particularmente con muestras degradadas o especies raras, La electroforesis en gel produce bandas débiles o ambiguas.. Para estas muestras, escalamos a electroforesis capilar o secuenciación de genes — técnicas de mayor resolución que proporcionan resultados definitivos. Estas pruebas de escalada se realizan sin costo adicional para garantizar que cada cliente reciba una respuesta concluyente..

RT-PCR frente a. Electroforesis en gel tradicional

SENO Biotech ofrece ambos métodos, seleccionar el protocolo óptimo en función del volumen de muestra, especies, y requisitos del cliente.